Estudo cinético da oligopeptidase A (OpdA) de Escherichia coli e determinação da importância do resíduo Tyr607 para sua atividade catalítica. / Kinetic study of oligopeptidase A (OPDA) from Escherichia coli and determination of the importance of residue Tyr607 to its catalytic activity.

AUTOR(ES)

Ricardo Zamprogno Lorenzon

FONTE

IBICT - Instituto Brasileiro de Informação em Ciência e Tecnologia

DATA DE PUBLICAÇÃO

31/03/2010

RESUMO

Oligopeptidase A (OpdA) é uma peptidase bacteriana membro da subfamília M3A que apresenta propriedades catalíticas e estruturais semelhantes às das peptidases de mamífero thimet-oligopeptidase (TOP) e neurolisina (NEL). As três enzimas apresentam quatro resíduos de tirosina conservados presentes na alça flexível que se encontra próxima ao centro ativo da enzima. Na OpdA, a alça flexível é formada pelos resíduos 600 a 614 (600SHIFAGGYAAGYYSY614). Na primeira etapa do trabalho fizemos a modelagem da OpdA tendo como base a estrutura cristalográfica da dipeptil carboxipeptidase de E.coli (Dcp). Os resultados indicaram que o resíduo Tyr607 da OpdA pode estar envolvido no reconhecimento do substrato, tendo uma grande importância na catálise enzimáticas. Assim, construímos dois mutantes da OpdA substituindo a Tyr607 por Phe (Y607F) e por Ala (Y607A) e examinamos a influência desta mutação sitio dirigida no processo catalítico. A hidrólise dos substratos derivados da sequencia Abz-GXSPFRQ-EDDnp (Abz = ácido orto-aminobenzóico; EDDnp = N- [2,4-dinitrofenil]-etilenodiamino; X = diferentes aminoácidos) pela OpdA wild type e pelas mutantes Y607F e Y607A foi sistematicamente estudado. Os resultados indicaram que enzima wild type clivou todos os peptídeos exclusivamente na ligação X-S enquanto que a Y607F e a Y607A hidrolisaram tanto a ligação X-S quanto a P-F. Os parâmetros cinéticos mostraram a importância da Tyr607 da OpdA para atividade catalítica, uma vez que sua substituição promoveu a diminuição nos valores de kcat/Km de até 100 vezes para a mutante Y607F e de até 1000 vezes para a mutante Y607A. No entanto, a mutação não afetou a conformação estrutural da proteína, como indicado pelas análises de CD e fluorescência intrínseca. Os resultados cinéticos confirmaram que o resíduo Tyr607 da OpdA tem importante papel na interação enzima-substrato e na atividade hidrolítica.

ASSUNTO(S)

1. família m3a 2. e. coli oligopeptidase 3. mutação sítio dirigida 4. substratos com supressão intramolecular de fluorescencia. biologia molecular

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