Estabelecimento de metodologias de análise do DNA livre plasmático para o diagnóstico Pré-natal não invasivo: sexagem fetal

AUTOR(ES)
FONTE

IBICT - Instituto Brasileiro de Informação em Ciência e Tecnologia

DATA DE PUBLICAÇÃO

18/02/2011

RESUMO

Neste trabalho propusemos e analisamos metodologias empregadas no uso da tecnologia dos Ácidos Nucléicos Livres de Células Fetais (cffDNA = Cell Free Fetal DNA) no diagnóstico pré-natal não invasivo (DPIN = Non-invasive Prenatal Diagnosis). Dada a modernidade das tecnologias empregadas e a sua repercussão nas famílias envolvidas, procuramos discutir algumas implicações éticas, sociais e legais. Ao contrário da crença popular de que a placenta constitui uma barreira impermeável entre mãe e filho, há tráfego bidirecional entre o feto e a mãe durante a gravidez. Vários estudos têm demonstrado que tanto células fetais intactas e ácidos nucléicos livres de células fetais (cffNA, ou seja, DNA e RNA) atravessam a placenta e circulam na corrente sanguínea materna. Identificamos quatro diferentes aplicações da tecnologia de análise do cffDNA: a) Determinação pré-natal do sexo, utilizada em gestações com risco de uma doença ligada ao sexo e realizada através da detecção do cromossomo masculino Y; b) O diagnóstico de certas doenças de gene único, normalmente através da detecção de mutação herdada paternalmente; c) Aneuploidia fetal, tal como a Síndrome de Down, onde há alterações cromossômicas; d) Detecção do tipo de sangue fetal em gestações com risco de incompatibilidade, sobretudo RhD. Para realizar este trabalho utilizamos a determinação pré-natal do sexo em 53 gestantes em diferentes períodos gestacionais. Para tal, testamos e propusemos metodologias de extração do DNA; amplificação do DNA extraído através da técnica da PCR (Polymerase Chain Reaction) e de uma nova metodologia denominada LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification); e a análise final dos resultados. Além disso, comparamos a eficiência da PCR e LAMP amplificando diferentes segmentos do cromossomo Y: DSY14 e TSPY. Em três casos as amostras foram descartadas porque não houve a confirmação do sexo fetal após os testes moleculares devido à perda de contato com as gestantes. Em outros dois casos os resultados apontaram para fetos masculinos, entretanto, no ultra-som eles foram confirmados como femininos, provavelmente devido a uma contaminção. No final obtivemos 28 amostras (58,33%) masculinas, com a amplificação das sequências do cromossomo Y e 20 amostras (41,67%) femininas que não amplificaram a sequência do cromossomo Y e apenas para o controle. Nossos resultados demonstraram que a amplificação por LAMP é mais eficiente que a PCR na análise de DSY14, sendo que o limite de detecção é de 10 pg e 0,1 pg, para a PCR e o LAMP, respectivamente. Concluímos que a amplificação utilizando a metodologia de LAMP é mais rápida (60 minutos) e apresenta uma alta especificidade, sensibilidade e não requer equipamentos sofisticados para reação, comparada com a técnica da PCR. Tais características viabilizam esta metodologia em laboratórios com poucos recursos.

ASSUNTO(S)

biologia molecular reação em cadeia de polimerase (pcr) lamp sexagem fetal dna fetal biotecnologia biofisica molecular fetal dna pcr lamp fentogram fetal sexing

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