Diagnose molecular do cancro bacteriano da videira causado por Xanthomonas campestris pv. viticola

AUTOR(ES)
DATA DE PUBLICAÇÃO

2007

RESUMO

A bactéria Xanthomonas campestris pv. viticola (Nayudu) Dye, agente do cancro bacteriano da videira, foi relatada pela primeira vez nas áreas irrigadas do Submédio do Vale São Francisco em Petrolina, Pernambuco, em 1998. A doença também foi identificada em Juazeiro, Bahia, e posteriormente no Piauí, no Ceará, Roraima e Goiás. O uso de material propagativo livre do patógeno tornou-se uma preocupação, uma vez que a ocorrência da bacteriose ainda esta restrita a essas regiões no país e existe o risco de disseminação para outras regiões produtoras no sul e sudeste do Brasil. Com o objetivo de desenvolver um método molecular para detecção e identificação dessa bactéria, três oligonucleotídeos iniciadores foram desenhados com base no seqüenciamento parcial do gene hrpB. As combinações de iniciadores Xcv1F/Xcv3R e RST2/Xcv3R foram testados quanto à especificidade e sensibilidade para detecção do DNA de X. campestris pv. viticola. Com os dois pares de iniciadores, a amplificação foi positiva com o DNA das 44 estirpes de X. campestris pv. viticola testados, com quatro estirpes da patovar mangiferaeindicae, e cinco estirpes de X. axonopodis pv. passiflorae. Contudo, a digestão dos produtos de PCR com HaeIII permitiu diferenciar as estirpes das três patovares. Nenhum dos dois pares de iniciadores amplificou o DNA de videira, de 20 bactérias não patogênicas da flora da videira, e de nove estirpes de outros sete gêneros de bactérias fitopatogênicas. A sensibilidade dos iniciadores Xcv1F/Xcv3R e RST2/Xcv3R foi de 10 pg e 1 pg de DNA purificado de X. campestris pv. viticola, respectivamente. O limiar de detecção de RST2/Xcv3R foi de 104 UFC/ml, mas empregando-se um segundo ciclo de amplificação com o iniciador interno Xcv1F, esse limiar foi reduzido para 102 UFC/ml. Os iniciadores foram testados na detecção da bactéria em pecíolos inoculados com a estirpe UnB 1186 e embora não se tenha tido sucesso na PCR com o extrato do macerado do tecido sintomático, foi possível detectar o patógeno usando-se lavado de placas após o crescimento por 72 h ou a partir de uma única colônia diluída em 200 μl de água. A identidade da bactéria foi confirmada pela análise de RFLP, que gerou o padrão típico de X. campestris pv. viticola. Com o uso de nested-BIO-PCR utilizando dois ciclos de amplificação com os iniciadores RST2/Xcv3R e Xcv1F/Xcv3R foi possível detectar X. campestris pv. viticola em plantas assintomáticas e sintomáticas, coletadas em março de 2007, em Petrolina, PE. Este método mostrou-se mais eficiente que a detecção direta, ou seja, sem uma etapa de enriquecimento em meio de cultura. Além disso, foi possível reduzir para 72 horas o tempo para detecção e identificação de X. campestris pv. viticola, tempo reduzido se comparado aos métodos convencionais. A alta similaridade observada entre as duas patovares, viticola e mangiferaeindicae de X. campestris foi comprovada através da análise de seqüências de nucleotídeos de diferentes regiões genômicas, ITS, 16S rRNA, hrpB6 e o gene do citocromo b561-like. Os resultados também sugeriram que as duas patovares estariam mais próximas filogeneticamente a X. campestris e X. axonopodis. Testes de inoculação cruzada em videira e mangueira mostraram a capacidade de X. campestris pv. mangiferaeindicae de infectar plantas de videira e confirmaram a patogenicidade de X. campestris pv. viticola à mangueira, quando a inoculação é feita por infiltração foliar. O estudo dos perfis plasmideais mostrou variabilidade entre as estirpes em relação ao número e tamanho dos plasmídeos, sendo o primeiro relato da presença de plasmídeos em X. campestris pv. viticola.

ASSUNTO(S)

xanthomas campestris pv. viticola diagnose cancro bacteriano da videira fitopatologia

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