Detecção e quantificação de células viáveis de Bacillus sporothermodurans e de Bacillus cereus em leite através de PCR convencional e de PCR em tempo real associadas ao propídio monoazida

AUTOR(ES)
FONTE

IBICT - Instituto Brasileiro de Informação em Ciência e Tecnologia

DATA DE PUBLICAÇÃO

31/10/2012

RESUMO

A presença de Bacillus spp. em leite representa um importante problema para a indústria de laticínios devido à sua capacidade de esporulação e à possibilidade de resistência do esporo ao tratamento térmico por ultra alta temperatura (UAT). O Bacillus sporothermodurans sobrevive ao sistema UHT, germinando e se multiplicando no leite estocado e, caso não seja corretamente quantificado e identificado, pode ultrapassar o limite estabelecido pela legislação para microrganismos mesófilos aeróbios, além de alterar a qualidade dos produtos lácteos quando em altas concentrações. Por outro lado, a contaminação de leite por Bacillus cereus constitui não somente uma importante causa de deterioração, mas também está associada com a ocorrência das síndromes emética e diarreica. Tradicionalmente, estes microrganismos são identificados e quantificados em alimentos através de técnicas clássicas de cultivo, mas métodos baseados na Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) também têm sido amplamente utilizados. Entretanto, a PCR não distingue células mortas de células viáveis, o que pode ser contornado com o emprego de intercalantes de DNA, como o propídio monoazida (PMA). O PMA se liga ao DNA derivado de células com membranas rompidas, impedindo suas amplificações na PCR, permitindo, assim, a detecção seletiva de células viáveis. Portanto, a presente tese teve por objetivo caracterizar a resistência térmica de B. sporothermodurans, bem como desenvolver métodos de detecção e quantificação de células viáveis de B. sporothermodurans e de B. cereus em amostras de leite através de PCR associada ao PMA. Tratamentos isotérmicos e não isotérmicos permitiram a determinação do perfil de resistência térmica de esporos de B. sporothermodurans ao processo UHT, predizendo que a 121C foi encontrado um valor D entre 2 a 4 min.A detecção e quantificação seletivas de B. sporothermodurans e de B. cereus através de PMA-qPCR foram desenvolvidas utilizando o gene RNAr 16S e o gene da hemolisina como alvos, respectivamente. O tratamento com PMA a partir de cultura pura e leite UHT artificialmente contaminado foi padronizado através da PCR convencional para a detecção de células viáveis destes microrganismos. A inibição da amplificação de DNA de células mortas foi obtida na concentração de 30μg/mL de PMA. A padronização dos ensaios de qPCR foram realizados utilizando sondas de hidrólise (sistema TaqMan) específicas para cada gene alvo. O limite de quantificação a partir de leite UHT artificialmente contaminado foi de 2,2 x 102 UFC/mL para B. sporothermodurans e de 7,5 x 102 UFC/mL para B. cereus. As técnicas foram aplicadas a 135 amostras de leite UHT de diferentes marcas comerciais, comparando com a metodologia clássica de cultivo para cada microrganismo. B. sporothermodurans e B. cereus foram, respectivamente, detectados em 14 (10,4%) e 44 (32,6%) das amostras analisadas pelos métodos moleculares desenvolvidos, e em 11 (8,1%) e 15 (11,1%) pelos métodos convencionais de cultivo. Os métodos de PMA-qPCR desenvolvidos neste estudo foram específicos e sensíveis para a detecção e quantificação de células viáveis de B. sporothermodurans e de B. cereus, mostrando-se aplicáveis para serem utilizados na avaliação de amostras de leite, reduzindo o tempo de análise deste produto. Além disso, os resultados demonstraram que B. cereus pode ser encontrado em leite tratado pelo sistema de UHT

ASSUNTO(S)

laticÍnios alimentos - microbiologia biologia geral biologia molecular biologia celular microbiologia

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