Detecção e isolamento de peptídeos antimicrobianos de folhas de Capsicum annum L. (pimentão Magali R) / Detection and isolation of antimicrobial peptides from leaves of Capsicum annum L. (bell pepper Magali R)

AUTOR(ES)
DATA DE PUBLICAÇÃO

2009

RESUMO

Peptídeos antimicrobianos (AMPs) têm atraído a atenção de pesquisadores como pontenciais compostos de defesa para serem usados no agronegócio. Eles apresentam mecanismos de ação diferentes dos compostos disponíveis comercialmente. O objetivo deste trabalho foi, por técnicas proteômicas, bioprospectar o potencial antimicrobiano de frações enriquecidas em peptídeos de folhas de pimentão (Capsicum annum Magali R) contra fitopatógenos de importância comercial, objetivando aplicação biotecnológica. Folhas de pimentão foram maceradas com tampão Tris acrescido de inibidores de proteases, o homogenato foi centrifugado, e o sobrenadante foi nomeado extrato solúvel (ES). O precipitado foi ressuspendido em solução de LiCl contendo inibidores de proteases, o homogenato foi centrifugado e o sobrenadante foi denominado extrato de parede celular (EP). Com o objetivo inicial de confirmar a presença de AMPs, os extratos de pimentão foram fracionados com sal (Sulfato de Amônio) e por cromatografias de exclusão molecular (CEM) e hidrofóbica (CH). P2-ES1 e P2-EP1 obtidas após a CEM, deram origem respectivamente a nove (H1 a H9) e oito (H1 a H8) picos promissores à avaliação antimicrobiana quando separados por CH, observando-se que P2-EP1 corresponde a uma fração menos complexa enriquecida em peptídeos. As frações H3 e H4 de P2-EP1 apresentaram alta atividade inibitória para duas bactérias-teste avaliadas, Ralstonia solanacearum (Gram-negativa) e Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Gram-positiva). Com o objetivo de simplificar o processo para futuras aplicações comerciais, procedimentos de ultrafiltração (1-10 kDa) substituíram os passos cromatográficos. Além das bactérias mencionadas acima, as frações recuperadas após ultrafiltração (ES1-10 e EP1-10) foram também capazes de inibir o crescimento da bactéria Erwinia carotovora subsp. carotovora e do fungo Alternaria solani. O crescimento das bactérias Pseudomonas syringae pv. tomato e Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli, e dos fungos Fusarium solani, Alternaria brassicicola, Pyricularia grisea e Rhizoctonia solani não foi inibido pelo extratos peptídicos. O procedimento de ultrafiltração foi essencial para a recuperação de grande quantidade de amostra parcialmente fracionada enriquecida em peptídeos. A etapa de ultrafiltração corresponde a um procedimento fácil, rápido e de baixo custo. E especialmente permite a recuperação de amostras nativas para ensaios biológicos. Para estudos analíticos das amostras, ES1-10 e EP1-10 foram submetidos à cromatografia de fase reversa em HPLC usando resinas C18 e C4 para purificação dos extratos. Para ES1-10 foram encontrados 13 picos promissores, e para EP1-10, 2 picos após C18-RPHPLC. Foi verificada a presença de bandas peptídicas após RP-C18- HPLC, principalmente no pico 3 de ES1-10, quando este foi ressubmetido à RP-C4-HPLC, originando o pico 3.1, que foi então submetido ao sequenciamento de aminoácidos. Por espectrometria de massa (MALDI/TOF-TOF), foram encontradas massas moleculares inferiores a 10 kDa para diversos picos provenientes da C18-RP-HPLC, e as seqüências aminoacídicas encontradas até então não apresentaram similaridade a peptídeos antimicrobianos relatados na literatura. Estes extratos antimicrobianos podem ser biotecnologicamente explorados para aplicação comercial como compostos de defesa.

ASSUNTO(S)

pimentão peptídeos proteinas peptides bell pepper

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