Detecção de genes de exotoxinas em Staphylococcus spp. isolados de leite cru refrigerado e de leite de vacas com mastite / Detection of exotoxin genes in Staphylococcus spp. isolates from refrigerated raw milk and milk from cows with mastitis

AUTOR(ES)
FONTE

IBICT - Instituto Brasileiro de Informação em Ciência e Tecnologia

DATA DE PUBLICAÇÃO

24/09/2010

RESUMO

Staphylococcus spp. tem sido frequentemente associado a surtos de origem alimentar, em virtude da capacidade de algumas espécies produzirem enterotoxinas, principalmente Staphylococcus aureus. A identificação laboratorial dessas espécies, bem como dos genes que codificam as enterotoxinas é um fator importante na elucidação de surtos de intoxicação estafilocócica. Dentre os alimentos envolvidos nessas intoxicações estão o leite e seus derivados, principalmente em decorrência da contaminação por patógenos causadores da mastite bovina, em especial Staphylococcus aureus. Assim, para avaliar o potencial toxigênico de isolados de leite, 264 estirpes de Staphylococcus spp., sendo 96 isolados de leite cru refrigerado e 168 isolados de leite de vacas com mastite foram usadas neste estudo. Dessas, 237 foram avaliadas também quanto às suas características morfológicas e à produção de hemolisina, 32 identificadas bioquimicamente por meio do sistema ID 32 Staph (bioMérieux) e 30 avaliadas quanto ao seu caráter de hidrofobicidade. Todas as estirpes foram analisadas pela técnica de Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) para a pesquisa do gene femA, específico de Staphylococcus aureus, para dez genes que codificam enterotoxinas estafilococicas (sea sell) e para o gene tst-1 que codifica a Toxina da Síndrome do Choque Tóxico. A análise morfológica foi realizada em ágar Baird-Parker (BP) e observando-se os aspectos das colônias quanto à sua cor, ao tamanho, ao brilho e à formação de halo devido à produção de lecitinase. A produção de hemolisinas foi verificada em ágar sangue. A detecção de genes para exotoxinas, incluindo enterotoxinas e toxina da síndrome do choque tóxico foi realizada utilizando-se primers descritos na literatura, após extração do DNA bacteriano e sua quantificação em espectrofotômetro (GeneQuant Pro, Amersham Biosciences). A amplificação do DNA foi feita utilizando-se sete reações, sendo cinco com primers para dois genes (seg/femA, seh/sei, seb/sell, sea/sed e sec/see) e duas reações com primers para apenas um gene-alvo (selj e tst-1). As amplificações foram feitas em termociclador GeneAmpÒ PCR System 9700 (Applied Biosystems). O cálculo de hidrofobicidade foi realizado pela medição do ângulo de contato entre a superfície bacteriana e três líquidos com diferentes polaridades, incluindo água, formamida e -bromonaftaleno, sobre uma camada de células vegetativas usando-se o aparelho Goniômtero (Kruss, Germany) e pelo resultado da energia livre global de interação (ΔGsws TOT). A detecçao do gene femA indicou que 14 e sete estirpes identificadas previamente como Staphylococcus Coagulase Negativa (SCN) e Staphylococcus Coagulase Positiva (SCP), respectivamente, tratavam-se de S. aureus. Dentre os isolados avaliados morfologicamente em Agar Baird-Parker e identificados bioquímica e molecularmente como S. aureus, apenas 18,7% (38/203) apresentaram colônias típicas. Observou-se que 64,5% (153/237) produziram hemolisina. Quanto às análises realizadas por meio do sistema ID 32 Staph (bioMérieux), 15,6% (5/32) apresentaram identificação diferente daquela realizada por provas bioquímicas tradicionais. Dentre as 264 estirpes analisadas molecularmente, 2,27% eram portadoras do gene tst-1 e foram isoladas de leite de tanque refrigerado. Os genes que codificam a produção de enterotoxinas estafilocócicas, foram verificados em isolados de leite armazenados em tanque de refrigeração e leite de vacas com mastite, ressaltando-se a presença dos genes que codificam a produção das novas enterotoxinas (seg-sell) (96,3%). Todos os isolados (17 isolados de leite proveniente de tanque refrigerado e 13 de leite de vacas com mastite) foram considerados hidrofílicos, tanto em relação à analise quantitativa (ΔGadesão>0), quanto para a análise qualitativa (<50). A presença de genes codificadores das enterotoxinas estafilocócicas demonstra a possibilidade de intoxicações e ressalta a importância no controle da mastite bovina bem como no controle da qualidade do leite.

ASSUNTO(S)

ciencia de alimentos leite mastite bovina biologia molecular estafilococos hidrofobicidade milk bovine mastitis molecular biology staphylococcus hydrophobicity

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