Construção de vetor baculoviral modificado capaz de produzir proteínas fusionadas à poliedrina

AUTOR(ES)

Márcio Hedil Oliveira da Costa

DATA DE PUBLICAÇÃO

2008

RESUMO

Este trabalho objetivou construir um vetor baculoviral modificado capaz de expressar proteínas heterólogas fusionadas à poliedrina e à cauda de hexahistidina e utilizar esse vetor para expressão e purificação da proteína capsidial de vírus do complexo viral do alho. Via PCR, foi sintetizado o fragmento PH (gene da poliedrina fusionado a uma cauda de hexa-histidina). Entre a poliedrina e a cauda de histidina foi inserido um sítio de NcoI. Na primeira tentativa de obtenção do fragmento PH, em vez do gene da poliedrina, a reação de PCR amplificou uma parte do genoma de Escherichia coli. Na segunda tentativa de obtenção do fragmento PH, o gene da poliedrina foi amplificado, contudo foi verificado que havia um erro no primer 5 utilizado, que gerou alteração da fase do fragmento PH. Somente na terceira tentativa (reação de PCR) o fragmento PH correto foi obtido. O fragmento PH foi clonado no vetor pFastBac1 (Invitrogen), gerando o vetor pFastPH. Um baculovírus recombinante vAcPH expressando a proteína PH foi construído via transposição sítio-específica utilizando o kit Bac-to-Bac (Invitrogen). Foi realizada análise da expressão de proteínas de células Tn5B infectadas com vAcPH (72 hpi). SDS-PAGE mostrou presença de uma proteína de peso molecular superior ao da poliedrina nativa e compatível com o esperado para a proteína PH. Western Blot mostrou que essa proteína é reconhecida tanto por anticorpo contra a poliedrina quanto por anticorpo contra a cauda de hexahistidina. Além da obtenção do fragmento PH correto, também foram sintetizados, via PCR, genes da capa protéica (de vírus presentes no complexo viral do alho: GarMbFV, GarV-C, GarV-D, LYSV, OYDV, GarCLV) flanqueados por sítios de NcoI. Esses genes foram comprovados por análise do padrão de restrição. Futuramente, tais genes poderão ser clonados no pFastPH para gerar baculovírus recombinantes expressando uma proteína de fusão poliedrina + proteína capsidial + cauda de hexa-histidina que poderá ser utilizada para produção de anticorpos.

ASSUNTO(S)

anticorpo allium sativum allium sativum poliedrina garlic viral complex complexo viral do alho biologia molecular baculovirus baculovírus polyhedrin antibody

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