Construção de cassetes de expressão lineares e transformação de Kluyveromyces marxianus para expressão de proteínas heterólogas / Construction of linear expression cassetes na transformation of Kluyveromyces marxianus for heterologous protein expression

AUTOR(ES)
FONTE

IBICT - Instituto Brasileiro de Informação em Ciência e Tecnologia

DATA DE PUBLICAÇÃO

15/02/2012

RESUMO

A escolha da levedura hospedeira para produção de uma proteína heteróloga é fundamental para o sucesso de um processo biotecnológico, porém, apesar da diversidade de trabalhos com expressão de proteínas em leveduras, os níveis de secreção nesses organismos ainda são considerados baixos quando comparadas aos fungos filamentosos. A levedura K. marxianus possui grande potencial biotecnológico para fermentação e produção de proteínas. Apesar desse potencial existem poucos trabalhos relatando a expressão heteróloga de proteínas nessa levedura. Este quadro demonstra a necessidade de mais estudos para padronização de um sistema fácil e eficiente para obtenção de K. marxianus recombinantes para produção de proteínas de interesse. O objetivo deste trabalho foi padronizar a construção de cassetes lineares para expressão de proteínas heterólogas em K. marxianus. Os cassetes de expressão foram construídos pela técnica de PCR de fusão. Para tanto foi realizado um primeiro ciclo de reação na qual foi amplificado individualmente cada fragmento integrante do cassete (o promotor, o gene de interesse e a marca de seleção). Os promotores escolhidos, ScHXT1p, ScPGKp, ScTDH3p, KmINU1p e KmPCPL3p, foram amplificados do genoma de S. cerevisiae ou K. marxianus. Os genes das enzimas endoglucanase e celobiohidrolase de Aspergillus níger (eng1e cbhA) foram clonados no vetor KLAC1 e este foi utilizado como molde para amplificação da sequência dos genes flanqueados pelas sequências do peptídeo sinal α-mating factor de Kluyveromyces lactis e do terminador do gene lac4 de Kluyveromyces lactis. A sequência codificadora do gene KanMX, marca de seleção que confere resistência em eucariotos para o antibiótico geneticina (G418), foi amplificado do DNA genômico de uma linhagem mutante de S. cerevisiae. O segundo passo consistiu da reação de fusão dos fragmentos de cada promotor com os fragmentos αMF-gene-TT e KanMX por PCR. Esse tipo de construção se mostrou eficiente, reprodutível e passível de ser realizada em tempo muito inferior àquele de métodos de clonagem tradicionais. Os cassetes construídos foram utilizados na transformação de leveduras Kluyveromyces marxianus UFV-3 por dois métodos, acetato de lítio e eletroporação. O protocolo de acetato de lítio foi mais eficiente e as colônias obtidas foram selecionadas por resistência às concentrações crescentes de G418.

ASSUNTO(S)

biologia molecular kluyveromyces marxianus proteínas heterólogas kluyveromyces marxianus heterologous protein

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