Construção de baculovírus recombinantes contendo o gene pré-pró-renina humana

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DATA DE PUBLICAÇÃO

2006

RESUMO

Baculovírus são vírus de insetos que têm sido utilizados como bioinseticidas para controle de pragas agrícolas, bem como importante ferramenta em Biotecnologia como vetor de expressão gênica. O sistema de expressão utilizando baculovírus em células de insetos fornece um ambiente apropriado para a síntese de proteínas eucarióticas. A renina humana, uma proteína produzida principalmente pelos rins e responsável pelo controle da pressão sangüínea e do balanço salino, é a chave principal para o desencadeamento do sistema renina-angiotensina-aldosterona que culmina no aumento da pressão sangüínea. Neste trabalho é proposta a produção da renina, com base na construção de baculovírus recombinantes, visando o estudo mais aprofundado tanto de suas propriedades quanto de inibidores que possam ser empregados na indústria farmacêutica. Inicialmente dois baculovírus recombinantes contendo o gene da pré-pró-renina humana foram construídos. No sistema vSyn VI-gal o fragmento da pré-pró-renina (~1,4 Kb) foi inserido no vetor de expressão pSynXIV VI+X3 e por recombinação homóloga com DNA viral levou a formação de vírus recombinante ocluso positivo. No sistema Bac-to-Bac (Invitrogen) o fragmento da pré-pró-renina foi inserido em bacmídeo, por transposição, e levou a formação de vírus recombinante ocluso negativo. A presença do gene da pré-pró-renina nos vírus recombinantes foi confirmada após amplificação do gene por reação em cadeia da polimerase (PCR) com os primers específicos da pró-renina. Para identificação das proteínas virais produzidas durante a infecção foi feita cinética da síntese de proteínas por marcação radioativa (35S-metionina), em células de inseto High five e Sf21, em diferentes tempos pós-infecção (0, 24, 48 e 72 h). Na fase muito tardia da infecção foi observada a síntese de duas proteínas de cerca de 40 kDa e 47 kDa, que correspondem ao peso molecular esperado para a pró-renina e a renina, ou formas glicosiladas da mesma. Como esperado, a análise das proteínas por ensaio imunológico, utilizando anticorpo policlonal contra a renina, mostrou sinal de hibridização nas amostras das células infectadas com os vírus recombinantes contendo o gene da pré-pró-renina (Sf21 e High five). Embora nas células High five não infectadas (mock infected) não tenha havido marcação com o anticorpo, foi, entretanto, detectado sinal de hibridização não esperado em células Sf21 não infectadas (mock infected), o que deve ser devido à hibridização inespecífica. A análise ultraestrutural das células infectadas com vírus recombinante revelou que houve indução de efeitos citopáticos típicos por infecção com baculovírus. Entretanto, no vírus recombinante ocluso positivo parece não ter havido a correta inclusão dos vírions na matriz protéica resultando na formação de poliedros com pouco ou nenhum vírion em seu interior. Finalmente, larvas de Anticarsia gemmatalis e de Spodoptera frugiperda foram infectadas para investigar as alterações morfológicas causadas pelos vírus. Sinais claros de que houve mudanças na fisiologia larval foram observados quando, além dos sintomas da doença, a lagarta infectada apresentou mudança de coloração do tegumento para cor rosa. Essa coloração não é observada na lagarta infectada com o vírus selvagem AcMNPV. As alterações ultraestruturais apresentadas pelas células e as mudanças na coloração da cutícula das larvas infectadas mostram que está havendo diferença na expressão protéica entre o vírus selvagem e os vírus recombinantes. Os resultados obtidos até o momento indicam ter havido a expressão de uma proteína com peso molecular esperado para a renina e que estaria interferindo, de alguma forma, no processo de oclusão da partícula viral bem como na fisiologia do inseto.

ASSUNTO(S)

outros genética baculoviroses patologia molecular microbiologia virologia - inseto

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