Clonagem e expressão de protease mitogênica de Carica candamarcensis

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DATA DE PUBLICAÇÃO

2009

RESUMO

As cisteíno-proteases são encontradas em vários organismos e se destacam por apresentar funções essenciais em parasitos, mamíferos e plantas. Várias plantas que são fontes dessas cisteíno-proteases pertencem à família Caricaceae, que tem como membro a espécie Carica candamarcensis. Uma das proteínas isoladas desse organismo, denominada CMS2MS2, é composta por 214 aminoácidos, possui atividade proteolítica e comprovada ação mitogênica em células de mamíferos. O objetivo desse trabalho foi produzir CMS2MS2 recombinante para posteriores estudos da atividade biológica e caracterização estrutural. Para a clonagem desse gene, foi utilizado um par de primers degenerados baseados na seqüência aminoacídica N-terminal e C-terminal da proteína CMS2MS2, cuja estrutura foi recentemente elucidada. Amplicons de aproximadamente 650 e 500 bp foram obtidos do cDNA, gerado por transcrição reversa a partir do RNA da folha da planta. A clonagem inicial do fragmento de 650 bp foi realizada no vetor pCR 2.1, que por sua vez foi transformado em bactérias Escherichia coli TOP10. Os clones positivos foram selecionados e a presença do fragmento de interesse verificada através de digestão, PCR e seqüenciamento do inserto. Foi possível observar pela análise dos clones F2 e E3 a existência de possíveis isoformas de cisteíno-proteases em C. candamarcensis. O inserto do clone F2 foi escolhido e em seguida excisado do plasmídeo pCR 2.1 com as enzimas XhoI e HindIII para sub-clonagem no vetor pET28a (+) TEV entre os sítios SalI e HindIII. O perfil de expressão dos clones em bactérias BL21-DE3 induzidas com 0,5 mM IPTG demonstrou uma proteína de aproximadamente 30 kDa, como esperado após a sub-clonagem, presente somente na fração insolúvel do lisado bacteriano. Testes de atividade mitogênica da proteína recombinante mostrou que essa proteína possui efeito proliferativo sobre fibroblastos L929 nas concentrações de 0,4 e 1 nM, enquanto que em osteobalstos obtidos de cultura primária induz mitogênese na concentração de 1 nM, faixas de concentração nas quais a enzima não-recombinante exibe atividade farmacológica.

ASSUNTO(S)

enzimas proteoliticas teses. carica decs cisteíno proteinase teses.

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