Clonagem do gene nahB de Pseudomonas putida G7 e expressão da enzima NahB envolvida na degradação do naftaleno, um componente do petróleo

AUTOR(ES)

Debora Maria Abrantes Costa

DATA DE PUBLICAÇÃO

2010

RESUMO

Os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) são compostos orgânicos formados por dois ou mais anéis aromáticos fundidos. A maioria deles é mutagênico e carcinogênico aos homens e animais. Os HAPs são liberados no meio ambiente principalmente por atividades antropogênicas, relacionadas à extração, ao transporte, ao refino, à transformação e ao uso do petróleo e seus derivados. A biorremediação é uma estratégia para a eliminação dos HAPs do meio ambiente, a qual utiliza enzimas ou microorganismos que possuem a capacidade de metabolizar esses compostos e transformá-los em substâncias inertes. O naftaleno é um dos HAPs mais comumente encontrado no ambiente. A degradação do naftaleno por Pseudomonas sp. é uma alternativa para a remediação de ambientes com esse poluente. Em Pseudomonas putida G7, os genes catabólicos são organizados em dois óperons no plasmídeo NAH7: um deles codifica as enzimas da via superior envolvidas na conversão do naftaleno a salicilato, o segundo codifica as enzimas da via inferior envolvidas na conversão do salicilato a intermediários do ciclo do ácido tricarboxílico. O gene nahB é responsável pela codificação da proteína cis-1,2-dihidro-1,2-dihidroxinaftaleno-1,2-desidrogenase (NahB), a qual é a segunda enzima da via superior. Nesse trabalho foi feita a clonagem do gene nahB em vetor pCR®2.1-TOPO e a subclonagem nos vetores de expressão pET-28a-GST-TEV e pET-28a-TEV. A expressão heteróloga da enzima NahB foi feita em RosettaTM (DE3) e ArticExpressTM (DE3). O vetor de expressão pET-28a-GST-TEV-NahB, responsável pela codificação da enzima GST-NahB, foi seqüenciado e a proteína recombinante está correta. Esta foi expressa na fração solúvel a baixas temperaturas, em RosettaTM (DE3) a 20ºC e em ArticExpressTM (DE3) a 12ºC. A purificação foi feita por cromatografia de afinidade e cromatografia de troca aniônica. Após a purificação, foi realizada a clivagem com a protease TEV. A proteína NahB proveniente da GST-NahB, permanece com três resíduos de aminoácidos além da sequência nativa e foi denominada GGS-NahB. A massa molecular dessa enzima recombinante foi determinada por espectrometria de massa e o valor foi bem próximo do teórico. Características estruturasis da enzima GGS-NahB foram determinadas por Espalhamneto Dinâmico da Luz e por Dicroísmo Circular. Pelo DLS, verificou-se que a proteína apresenta-se monodispersa e na forma tetramérica em solução. Os experimentos de CD evidenciaram uma enzima com aproximadamente 25% de -hélice, 30% de fita- paralela e antiparalela, 15 % de volta beta e 40% de estrutura randômica. Novas purificações estão sendo conduzidas para a realização de ensaios de cristalização. O vetor de expressão pET-28a-TEV-NahB, também foi seqüenciado e a proteína recombinante His-NahB apresenta, após a clivagem com a protease TEV, ao invés de dois resíduos de aminoácidos além da sequência nativa, 21 resíduos. O gene nahB será, novamente, subclonado no vetor pET-28a-TEV para expressão da enzima His-NahB.

ASSUNTO(S)

pseudomonas teses. biorremediação teses. bioquímica teses.

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