Clonagem and expression of protein EGFP in the region intergenic E/NS1 of cepa vaccine 17D of the virus of the Yellow Fever. / Clonagem e expressão da proteína EGFP na região intergênica E/NS1 da cepa vacinal 17D do vírus da Febre Amarela.

AUTOR(ES)
DATA DE PUBLICAÇÃO

2007

RESUMO

O vírus da Febre Amarela (FA) é o membro protótipo do gênero Flavivírus. Para estes, a única vacina de vírus atenuado, disponível e licenciada até o momento é a da Febre Amarela, que é composta pelo vírus vacinal da cepa 17D. Este projeto tem como objetivo geral o estabelecimento de uma nova estratégia de expressão de proteínas heterólogas na região intergênica E/NS1 e, como objetivos específicos, a construção de dois diferentes vírus FA recombinantes expressando EGFP e a caracterização dos vírus recombinantes quanto às suas propriedades biológicas e de estabilidade genética. Esta abordagem baseou-se nos motivos funcionais e na seqüência de aminoácidos conservados flanqueadores da região intergênica E e NS1 , os quais foram duplicados e fusionados ao gene heterólogo permitindo, desta forma, o correto processamento da poliproteína precursora viral. A região intergênica E/NS1 foi testada quanto à tolerância da inserção e expressão da proteína no vírus recombinante, por meio de duas construções utilizando o gene repórter EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) de Aequoria victoria, o qual tem como produto uma proteína de 238 aminoácidos. Nos dois diferentes vírus FA recombinantes expressando EGFP, o gene heterólogo foi fusionado a uma seqüência correspondente aos 27 nucleotídeos 5- terminais do gene da proteína NS1 e, no seu C-terminal, aos domínios haste e âncora, completos ou parciais. Desse modo, a presente dissertação descreve a construção dos vírus expressando EGFP de Aequoria victoria na região intergênica E/NS1 do genoma viral FA, a determinação das suas propriedades de crescimento em monocamadas celulares (cinética de crescimento viral e fenótipo de placa de lise) e a estabilidade genética das amostras virais após passagens seriadas em monocamadas celulares através da análise das placas de lise, RTPCR e Citometria de Fluxo. A regeneração dos vírus recombinantes foi bem sucedida e a expressão e estabilidade da proteína confirmada através da detecção de fluorescência e análise do fenótipo de placa, indicando que a inserção do gene não influencia consideravelmente a viabilidade viral. A caracterização biológica de cinética de crescimento viral dos vírus recombinantes apontou no sentido de que as modificações genéticas introduzidas no genoma FA não acarretaram em um grande comprometimento da estrutura e função viral. Estes resultados são importantes pois, até o momento, não se conseguiu expressar estavelmente no genoma de flavivírus proteínas exógenas, devido à instabilidade genética destas inserções, que são deletadas do genoma viral.

ASSUNTO(S)

febre amarela dna intergenic yellow fever vaccine vacina contra febre amarela flavivirus yellow fever dna intergênico flavivirus biofisica celular

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