Caracterização de regiões de integração de minicírculos de kDNA de trypanosoma cruzi no genoma humano

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DATA DE PUBLICAÇÃO

2008

RESUMO

A integração de minicírculos de kDNA do Trypanossoma cruzi no genoma hospedeiro foi correlacionada com alterações na expressão gênica. Com a finalidade de caracterizar as regiões híbridas e ampliar o conhecimento biológico realizou-se os isolamentos e clonagens dos minicírculos integrados no genoma de macrófagos humanos em cultura e de tecidos de coelhos chagásicos. Observou-se instabilidade genética dos segmentos que continham as integrações. As clonagens realizadas em diferentes combinações de vetores e hospedeiras não evitaram os rearranjos. A análise de restrição e o seqüenciamento dos segmentos recuperados mostraram alterações no tamanho e na estrutura do vetor. A técnica de captura desenvolvida no presente estudo permitiu confirmar a instabilidade genética dos minicírculos preferencialmente integrados. A análise de restrição e o seqüenciamento desses fragmentos mostraram que os minicírculos recuperados apresentaram encurtamentos nas regiões variáveis em relação ao padrão descrito na literatura. Verificou-se que o encurtamento ocorreu durante ou após a integração no genoma. As regiões variáveis encurtadas de 50 pb foram recuperadas das linhagens subclonais de macrófago A11, C4, C6 e coração de coelhos chagásicos. Quando comparadas entre si essas regiões apresentaram similaridade na ordem de 90%. Em relação à região variável 80 pb, recuperada do macrófago C6, a similaridade foi em torno de 75%. O resultado sugeriu a existência de classes de minicírculos que se integram preferencialmente no genoma hospedeiro. Foram obtidos clones híbridos estáveis contendo o final da região conservada nas extremidades seguidas pela região variável truncada, fragmento de elemento LINE-1, com ou sem a presença de microssatélite. A origem híbrida foi confirmada por fragmentação do clone que foi utilizado como sonda na hibridação de macrófagos humanos normais e DNA de T. cruzi. O segmento B7, obtido por captura, apresentou o minicírculo de kDNA com 4 regiões variáveis truncadas, intercaladas por regiões conservadas normais seguidas do microssatélite CA e da região humana com similaridade ao clone murino AC131797.3. A análise in silico do segmento B7 mostrou a presença de seqüências regulatórias da expressão gênica. Foram identificadas 9 possíveis ORFs, sendo duas compreendo a região híbrida (ORF1 e 2). Verificou-se nas integrações recuperadas de coração de coelhos chagásicos segmentos similares à região humana encontrada no clone B7, indicando a recorrência dos sítios recombinativos. A análise in silico do clone B7, G10 e das regiões hospedeiras obtidas dos bancos de dados mostrou a presença de estruturas do tipo não B nos locais próximos ao ponto de recombinação. A presença da estrutura não B no segmento B7 foi confirmada pela alteração na mobilidade eletroforética. Em todos os pontos de entrada do minicírculo no genoma hospedeiro verificou-se a redução da tensão local e aumento da tensão global na região, sugerindo a possibilidade de ocorrência de novos eventos recombinativos envolvendo o segmento. O conjunto das informações indica que a integração é mediada por recombinação homologa mediada por similaridades estruturais presentes no DNA hospedeiro e minicírculo de kDNA.

ASSUNTO(S)

genetica molecular e de microorganismos instabilidade genética minicírculo kdna t. cruzi transferência horizontal de genes

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