Bmcystatin, cysteine protease inhibitor present in fat body of Boophilus microplus tick: Cloning, expression, purification and characterization. / BmCistatina, Inibidor de cisteinoproteases presente em corpo gorduroso de carrapato Boophilus microplus: Clonagem, expressão, purificação e caracterização.

AUTOR(ES)
DATA DE PUBLICAÇÃO

2006

RESUMO

A importância econômica dos carrapatos está relacionada a seus hábitos hematofágicos. Entre as espécies que pertencem à família Ixodidae, o carrapato Boophilus microplus tem grande importância veterinária por ser vetor de patógenos, atuando como ectoparasito em animais domésticos e silvestres, transmitindo a doença conhecida como o babesiosis e febre do gado. O método de controle convencional tem sido o uso de acaricidas; no entanto, formas alternativas como o controle imunológico, estão sendo investigadas. Os inibidores de proteases têm um papel fundamental na regulação da proteólise, sendo as enzimas alvo de origem endógena ou exógena, permitindo a regulação da velocidade de proteólise. Estes inibidores são moléculas produzidas por hematófagos que merecem destaque, visto a necessidade de controle das inúmeras proteases envolvidas no sistema hemostático e imune do hospedeiro. Cistatinas são inibidores naturais de cisteinoprotease (família C1) do tipo papaína e estão envolvidas em processos fisiológicos como processamento de antígeno, resposta imunomodulatória, diferenciação celular, e também em processos patológicos como metástase e inflamação. O presente trabalho descreve a caracterização da Bmcistatina recombinante isolada do corpo gorduroso do B. microplus. A seqüência completa de nucleotídeos da Bmcistatina (298 pb) foi obtida através do sequenciamento de nucleotídeos de clones aleatórios de uma biblioteca de cDNA de corpo gorduroso. A proteína recombinante foi produzida utilizando o vetor de expressão pET26b e a cepa E. coli BL21 SI. A Bmcistatina foi induzida com 0,3 M de NaCl e extraída por French press na forma solúvel. A purificação foi realizada por cromatografia de afinidade em resina Ni-NTA agarose seguida de cromatografia de troca iônica HiTrap Q. Bmcistatina apresentou massa molecular de 11 kDa, e forte atividade inibitória para catepsina L com Ki de 0,1 nM. A seqüência de aminoácidos apresentou 70% de similaridade com uma cistatina de carrapato Ixodes scapularis. A análise da expressão gênica de Bmcistatina por PCR semiquantativo mostrou amplificação de banda apenas em preparação de cDNA de corpo gorduroso; por outro lado, a presença de proteínas de tamanhos similares reconhecidas pelo anticorpo anti-Bmcistatina foi observada em extratos de corpo gorduroso e glândulas salivares de B. microplus utilizando experimento de Western blot. Com o intuito de entender a função da Bmcistatina, esse trabalho gerou ferramentas como o anticorpo anti- Bmcistatina e a seqüência do gene de Bmcistatina, que serão importantes para a confirmação da localização dessa proteína nesse ectoparasito e permitirão também a utilização da metodologia de interferência de RNA em estudos funcionais futuros.

ASSUNTO(S)

biologia molecular 1. boophilus microplus. 2. hematófago. 3. inibidores. 4. cistatina. 5. cisteinoproteases. 6. estefinas

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