Avaliação de técnicas miniaturizadas de preparação de amostras na análise enantiosseletiva de fármacos quirais com diferentes características ácido-base em meio microssomal e aplicação em estudos de metabolismo in vitro / Evaluation of microextraction techniques for sample preparation for the enantioselective analysis of chiral drugs with different acid-base characteristics in microsomal medium and application to in vitro metabolism studies

Rodrigo Almeida Simões

Neste trabalho, a microextração em fase líquida com membrana cilíndrica oca (HF-LPME), a microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME) e a microextração em fase sólida na configuração de um filme delgado (SPME/TFME) foram empregadas como técnicas de microextração para a preparação de amostras microssomais no estudo de metabolismo in vitro de fármacos quirais com diferentes características ácido-base. Para análise empregou-se a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com detector por absorção no UV e a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS-MS). O fármaco neutro isradipina (ISR) foi o primeiro a ser abordado. Um método estereosseletivo empregando HFLPME- HPLC foi desenvolvido para a determinação dos enantiômeros da ISR e seu principal metabólito (um derivado piridínico da isradipina - PDI) em fração microssomal isolada de fígado de ratos. Os analitos foram extraídos de 1 mL de meio microssomal utilizando o procedimento HF-LPME na configuração duas fases, tendo o solvente acetato de hexila como fase aceptora. Pela primeira vez, o PDI e os enantiômeros da ISR foram resolvidos numa mesma corrida cromatográfica. Para esta separação foi utilizada uma coluna Chiralpak AD® e hexano:2-propanol:etanol (94/04/02, v/v/v) como fase móvel, na vazão de 1,5 mL min-1. A ISR e o PDI foram detectados em 325 nm e o padrão interno, oxibutinina, foi detectado em 225 nm. A validação do método mostrou valores de recuperação de 23% para o PDI e 19% para cada enantiômero da ISR, 50 ng mL-1 como limite de quantificação (LOQ) para todos os analitos e linearidade entre 50-5000 ng mL-1 e 50-2500 ng mL-1 para o PDI e cada enantiômero da ISR, respectivamente. O método desenvolvido e validado foi aplicado em um estudo de metabolismo in vitro, utilizando microssomas hepáticos de ratos, mostrando que o (+)-(S)-ISR foi preferencialmente metabolizado. Do mesmo modo que para a ISR, um método analítico empregando HF-LPME-HPLC no modo três-fases foi desenvolvido para a análise estereosseletiva concomitante do bufuralol (BF) e dos seus principais metabólitos 1\ - oxobufuralol (1\ -Oxo-BF) e 1\ -hidroxibufuralol (1\ -OH-BF) em preparações microssomais. As análises por HPLC foram conduzidas empregando uma coluna Chiralcel OD-H® com fase móvel composta por hexano:2-propanol:metanol:dietilamina (97,5/2,0/0,5/0,5, v/v/v/v), na vazão de 1,5 mL min-1 e detecção em 248 nm e 273 nm. As condições otimizadas da HFLPME foram: n-octanol como solvente orgânico, ácido acético 0,2 mol L-1 como fase aceptora, fase doadora com pH ajustado em 13 e agitação de 1500 rpm por 30 min. O método foi validado e apresentou valores de recuperação entre 63 - 69% para os analitos e mostrou-se linear entre 100 - 5000 ng mL-1 para cada enantiômero do 1\ -Oxo-BF e 100 - 2500 ng mL-1 para cada estereoisômero do 1\ -OH-BF (r >0,99), com LOQ de 100 ng mL-1 para todos os analitos. O método desenvolvido e validado foi aplicado em um estudo de metabolismo in vitro do BF utilizando microssomas hepáticos de ratos, que mostrou formação predominante do (S)-1\ -Oxo-BF e do (R,R)-1\ -OH-BF. Um segundo fármaco básico abordado neste trabalho foi a ranolazina (RNZ). Para a análise enantiosseletiva da RNZ e de um de seus metabólitos (desmetil ranolazina - DRNZ) em fração microssomal isolada de fígado de ratos, foi desenvolvido um método estereosseletivo empregando a DLLME-LC-MS-MS. Os analitos foram extraídos de 0,5 mL de meio microssomal utilizando o procedimento DLLME, tendo o clorofórmio como solvente extrator e acetona como solvente dispersante. Pela primeira vez os enantiômeros da RNZ e DRNZ foram resolvidos numa mesma corrida cromatográfica. ii Para esta separação foi utilizada uma coluna Chiralcel OD-H® e hexano:etanol (60/40, v/v) e 0,05% de dietilamina como fase móvel, na vazão de 1,0 mL min-1. A validação do método mostrou valores de recuperação em torno dos 55 e 45% para os enantiômeros da RNZ e DRNZ, respectivamente. Os LOQ foram de 25 ng mL-1 para cada enantiômero da RNZ e 10 ng mL-1 para cada enantiômero da DRNZ. A linearidade foi estabelecida entre 10-1000 ng mL-1 e 25-2500 ng mL-1 para cada enantiômero da DRNZ e RNZ, respectivamente. O método desenvolvido e validado foi aplicado em um estudo de metabolismo in vitro utilizando microssomas hepáticos de ratos, mostrando que a metabolismo da RNZ foi enantiosseletivo. Finalmente, um método analítico empregando a SPME/TFME-LC-MS-MS foi desenvolvido para a análise simultânea do fármaco anfótero repaglinida (RPG) e dois dos seus principais metabólitos, a 2-despiperiril-2-amino-repaglinida (DA-RPG) e a 2-despiperidil-2-(5- carboxipentilamina)-repaglinida (DC-RPG) em fração microssomal isolada de fígado humano. A SPME/TFME foi conduzida com o auxílio do equipamento Multi Sampler SPME nas seguintes condições: pré-condicionamento dos blades com 1 mL de uma solução metanol:água (50/50, v/v) por 30 min, 60 min de extração e 90 min de dessorção com 1 mL de fase móvel. A análise por LC-MS-MS foi feita empregando uma coluna cromatográfica C18 em modo reverso, com fase móvel composta por acetonitrila:água (50/50, v/v) e 0,1% de ácido acético, na vazão de 0,5 mL min-1. A validação do método mostrou valores de recuperação acima dos 80% para todos os analitos. O LOQ foi de 2 ng mL-1 para todos os analitos, sendo o método linear no intervalo 2-1000 ng mL-1 para a RPG e 2-500 ng mL-1 para a DA-RPG e DC-RPG. Os analitos foram estáveis durante todo o protocolo analítico e de metabolismo. O método validado foi aplicado em um estudo de metabolismo in vitro utilizando microssomas hepáticos de humanos, mostrando que o perfil metabólico da RPG e a taxa de formação da DA-RPG e DC-RPG é alterada em função da concentração de proteínas microssomais no meio de incubação e também em função do tempo de incubação. Além disso, os resultados mostrama possibilidade de haver diversos outros metabólitos que não foram monitorados.

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