Aperfeiçoamento de cultivos de alta densidade celular de rE.coli utilizando glicerol como fonte de carbono

AUTOR(ES)
FONTE

IBICT - Instituto Brasileiro de Informação em Ciência e Tecnologia

DATA DE PUBLICAÇÃO

20/07/2011

RESUMO

As doenças pneumocócicas são uma das maiores causas de mortalidade mundial e por isso, o desenvolvimento de novas vacinas contra Streptococcus pneumoniae é crucial para tornar mais eficiente a prevenção contra as doenças causadas por essa bactéria. A proteína de superfície de pneumococo A (PspA) é um importante fator de virulência, sendo uma potencial candidata à antígeno vacinal. Por isso, um fragmento recombinante do gene da PspA foi clonado no plasmídeo pET37b e este foi inserido em células de E. coli BL21(DE3) para a produção da proteína em cultivos de alta densidade celular (HCDC). O modo de operação em batelada alimentada é o mais frequentemente empregado para obter altas densidades celulares em culturas de E. coli recombinante. Antes de realizar um HCDC de E. coli, é normalmente necessário decidir entre o uso de glicose ou glicerol como fonte de carbono em um meio definido ou complexo, tendo IPTG ou lactose como agentes da indução. Glicerol apresenta um excelente potencial como fonte de carbono já que sua assimilação não provoca a formação de metabólitos indesejados, mesmo quando altas velocidades de crescimento são observadas. No entanto, o glicerol é geralmente usado simplesmente como um substituto da glicose em meios de cultivo formulados tendo a última como fonte de carbono. Além disso, a maioria das estratégias de indução em biorreator tem sido baseadas em uma transposição dos estudos de indução em frascos agitados. No presente trabalho, as composições dos meios definidos empregados tanto na batelada como na alimentação foram modificadas visando obter um melhor desempenho do processo tendo glicerol como substrato limitante. Os experimentos foram realizados em biorreator de 5 L, utilizando controle automático da alimentação exponencial e glicerol como fonte de carbono. A formulação do meio definido de cultivo comumente utilizado em HCDCs foi modificada para melhorar o desempenho do processo para glicerol como substrato limitante do crescimento e estudou-se a indução com IPTG e lactose. Velocidades específicas de crescimento de até 0,57 h-1, fator de conversão de substrato a células na ordem de 0,56 g (DCW)/ gglicerol e produtividades celular em torno de 6,0 g (DCW)/L h foram obtidos em HCDC de rE. coli de curta duração devido, principalmente, ao aumento da concentração de tiamina no meio, adição de sais de fosfato no meio de alimentação e aumento da temperatura da fase de crescimento para 37C. O desempenho da lactose como indutor foi investigado através da implementação de uma estratégia de indução inovadora, baseada na adição de um pulso de lactose seguido por um fornecimento contínuo de lactose junto com glicerol no meio de alimentação. Os resultados indicaram produtividade celular [1,3 g (DCW)/L h], rendimento máximo de proteína (220 mgproteína/g DCW) e concentração protéica (26 gproteína/L) semelhantes ao se utilizar IPTG ou lactose. Estes valores são significativamente maiores do que alguns dos melhores relatados na literatura, confirmando a eficácia da estratégia proposta para a formação de biomassa e produção protéica. O glicerol mostrou um excelente desempenho como fonte de carbono, possibilitando altas velocidades de crescimento celular sem formação de acetato. O controle automático do perfil de alimentação exponencial, juntamente com as estratégias de cultivo empregadas, resultou em maiores velocidades de crescimento celular e produção de proteína, levando a cultivos mais curtos, com maiores produtividades e, consequentemente, menores custos de produção. Este trabalho é uma contribuição importante para estudos de HCDC com glicerol como fonte de carbono e lactose como indutor.

ASSUNTO(S)

engenharia quimica engenharia química e. coli recombinante batelada alimentada glicerol

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