Análise morfofuncional e imuno-histoquímica das células de Leydig e dos macrófagos testiculares em ratos, após a exposição à nicotina durante as fases pré-natal e de lactação / Morphofunctional and immunohistochemical analysis of the Leydig cells and testicular macrophages in rats, after nicotine exposure during the prenatal phase and lactation

Camila Cicconi Paccola Nizoli

A nicotina e altamente consumida, por ser um componente do cigarro. Em gestantes, atravessa a membrana placentaria e esta presente no leite materno. A nicotina induz apoptose em celulas de diferentes orgaos, interfere nas funcoes endocrinas e pode causar atrofia testicular, disfuncoes de erecao e das gonadas, bem como infertilidade masculina. Ela tambem suprime a secrecao de testosterona em ratos tratados na fase adulta. Como a testosterona e produzida por celulas de Leydig a partir do colesterol e este mecanismo envolve a participacao de macrofagos testiculares (importantes para o desenvolvimento pos-natal da celula de Leydig), gerou-se a hipotese de que a nicotina poderia provocar toxicidade testicular via alteracoes morfofuncionais em celulas de Leydig, com possivel envolvimento dos macrofagos. Desta forma, o objetivo desta pesquisa foi investigar se a nicotina administrada a ratas prenhes e lactantes, em dose equivalente a um maco diario de cigarros, consumida por gestantes fumantes, provoca na prole: a) alteracoes dos niveis plasmaticos e intratesticulares de colesterol e dos hormonios sexuais; b) alteracao morfologica e das densidades numericas de celulas de Leydig e macrofagos testiculares; Para tanto, 22 ratas foram tratadas com nicotina durante a gravidez e a lactacao. A nicotina foi administrada atraves de uma minibomba osmotica, calibrada de forma a liberar 2 mg/kg/dia de nicotina (equivalente ao consumo de 20 cigarros/dia). A minibomba foi implantada subcutaneamente, no dorso da rata, no primeiro dia de prenhez e substituida no 1 dia apos o nascimento (periodo de lactacao), garantindo a exposicao ate o desmame (22dpp). Minibombas sem nicotina foram implantados em outras 22 ratas prenhes e lactantes (grupo controle gShamh) com o objetivo de verificar a inocuidade deste procedimento. Mais 22 ratas prenhes e lactantes nao receberam qualquer tratamento ou manipulacao (grupo controle absoluto). Os filhotes machos provenientes de cada rata foram distribuidos em 4 subgrupos de acordo com a idade de eutanasia (1, 30, 60 e 90dpp). Apos a analise biometrica (peso e volume), os testiculos foram processados para analise histopatologica (historresina e parafina; metodo do PAS+H) e para analises imuno-histoquimicas (inclusoes em parafina) para marcacao de celulas de Leydig adultas (anticorpo anti-enzima esteroidogenica 11À-HSD II) e de macrofagos residentes (anticorpo anti-ED2). As densidades numericas das celulas de Leydig e dos macrofagos foram computadas atraves do sistema de analise de Imagem Leica Q-Win. Foram realizadas dosagens plasmáticas de colesterol e testosterona (em todas as idades) e estradiol (30, 60 e 90 dias), além das dosagens intratesticulares de colesterol e testosterona (60 e 90 dias). Para comprovação da presença de nicotina no leite e de sua transferência para os filhotes, a nicotina e seu metabólito, a cotinina, além de seus subprodutos, foram detectados no leite materno, na urina e no plasma dos filhotes em fase de amamentação, por cromatografia. Os resultados da cromatografia confirmaram a passagem destas substâncias para a circulação sanguínea dos neonatos. Animais do subgrupo tratado apresentaram, ao nascimento, redução de peso corpóreo (p<0,05) e do colesterol plasmático (p<0,05), além de uma sugestiva redução da quantidade de gotículas de lipídeo no citoplasma das células de Leydig fetais. Aos 30 dias de idade, os testículos da prole exposta à nicotina apresentaram redução do peso (p<0,05) e do volume testicular (p<0,05) em relação ao controle absoluto. Aos 60 e 90 dias, os animais dos subgrupos tratados apresentaram peso corpóreo levemente maior (p<0,05) que o subgrupo controle absoluto e, aos 90 dias, tanto a dosagem de colesterol (p<0,05) quanto a dosagem de testosterona plasmática foram maiores no subgrupo tratado (p<0,05) em relação a ambos os controles. Embora não tenham ocorrido diferenças nas densidades numéricas de células de Leydig e macrófagos, a análise histopatológica mostrou, aos 60 e 90 dias, uma incidência maior de células de Leydig em degeneração, além de intensa descamação e desorganização do epitélio seminífero. Aos 90 dias, acompanhando o aumento de colesterol e testosterona, observou-se também uma sugestiva hipertrofia das células de Leydig e maior incidência de anáfases e metáfase meióticas, além de núcleos de célula de Sertoli soltos no lúmen. Como os níveis de estradiol se mostraram sutilmente reduzidos nas três idades analisadas (30, 60 e 90 dias), é possível que a ação da nicotina sobre o testículo possa ter provocado também alterações das células de Sertoli. Concluiu-se que a nicotina afeta o metabolismo de colesterol e testosterona, causa alterações morfofuncionais nas células de Leydig e alterações da espermatogênese e provoca redução do número de neonatos oriundos de ratas tratadas durante toda a prenhez, induzindo nestes a ocorrência de baixo peso corpóreo e de baixo índice de colesterol plasmático. Contudo, alterações quantitativas das populações de células de Leydig e de macrófagos testiculares das proles não foram observadas nas diferentes fases do desenvolvimento sexual.

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