Purification, biochemical caracterization and biotechnological uses of α-galactosidases from Aspergillus terreus / Purificação, caracterização bioquímica e aplicações biotecnológicas de α-galactosidases de Aspergillus terreus

AUTOR(ES)

Angélica Pataro Reis

DATA DE PUBLICAÇÃO

2007

RESUMO

A enzima α-Galactosidase (α-D-galactosideo galactohidrolase, EC 3.2.1.22) catalisa a clivagem de resíduos terminais α-1,6- galactosil presentes em vários substratos, incluindo oligossacarídeos lineares e ramificados, polissacarídeos e substratos sintéticos tal como o p-nitrofenil-α-D- galactopiranosídeo (ρNPαGal). A α-galactosidase é de grande importância devido seu potencial em aplicações industriais. Dentre estas a capacidade em hidrolisar os oligossacarídeos de rafinose (RO) que são os principais fatores responsáveis por distúrbios gastrintestinais relacionados com a ingestão de produtos derivados de soja. A mucosa intestinal de humanos e animais monogástricos não possui a enzima α-galactosidase, essencial para a hidrólise desses oligossacarídeos. Portanto a redução desses açúcares nos derivados de soja poderá melhorar as qualidades nutricionais desses alimentos. O objetivo deste trabalho foi produzir, purificar e caracterizar α- galactosidases de Aspergillus terreus, avaliando sua capacidade hidrolítica sobre os oligossacarídeos de rafinose (RO) presentes em produtos de soja. O fungo Aspergillus terreus cresceu em meio mineral líquido contendo farelo de trigo como fonte de carbono por 168 horas a 28 C. Para obtenção da α-galactosidase purificada E1 e parcialmente purificada E2, foram utilizadas cromatografias de gel filtração, interação hidrofóbica, troca iônica e afinidade. Foi também utilizado gel nativo como última etapa de purificação da α-galactosidase E1. Atividades máximas das α-galactosidases E1 e E2 foram detectadas em pH 5,0 e 5,5 e nas temperaturas de 60 e 50 oC, respectivamente. A enzima α-galactosidase E1 manteve 90% de sua atividade inicial quando pré-incubada por 12 horas a 55 C e a α-galactosidase E2 manteve apenas 5 % da sua atividade quando pré-incubada nas mesmas condições. Os valores da KM para ρNPαGal, melibiose, estaquiose e rafinose para a α-galactosidase E1 foram de 0,66, 1,92, 10,94 e 27,93 mM, respectivamente, enquanto que, para a α-galactosidase E2 o KM para ρNPαGal e melibiose foram de 0,20 e 20,14 mM, respectivamente. As α-galactosidases apresentaram especificidade para galactose em posição α, hidrolisando o substrato sintético ρNPαGal, estaquiose, rafinose e melibiose. Sulfato de cobre, cloreto de mercúrio, nitrato de prata e SDS inativaram totalmentes as duas enzimas, enquanto que sulfato de zinco inativou totalmente a α-galactosidase E1 e reduziu 48 % a atividade da α-galactosidase E2. A α-galactosidase E2 na presença do substrato ρNPαGal sofreu inibição competitiva com galactose (Ki 0,76 mM). Para o substrato ρNPαGal foi encontrada uma energia de ativação igual a 51,17 e 36,71 kJ/mol para as α-galactosidases E1 e E2, respectivamente. Para o substrato melibiose a energia de ativação para a α-galactosidase E1 foi de 53,83 kJ/mol e para a E2 foi 39,83 kJ/mol. Para os substratos rafinose e estaquiose, a energia de ativação encontrada foi de 55,18 e 42,81 kJ/mol, respectivamente, para a α-galactosidase E1. Os resultados dos tratamentos do extrato desengordurado de soja com as α-galactosidases E1 e E2 mostraram uma redução de 100% da estaquiose após 12 horas de incubação, porém a rafinose ainda permaneceu 24 % a mais que o teor inicial, fenômeno que pode ser justificado pelo fato deste açúcar ser um dos produtos da hidrólise da estaquiose havendo então um acúmulo de rafinose. Para a α-galactosidase E2, ao final de 12 horas de incubação com o extrato desengordurado, 18 e 25 % dos açúcares rafinose e estaquiose foram hidrolisados, respectivamente. Portanto, observa-se que preferencialmente a α-galactosidase E1 pode ser utilizada para redução dos RO, sendo indicada para utilização industrial no processamento destes açúcares.

ASSUNTO(S)

enzimologia aspergillus terreus caracterização bioquímica -galactosidases -galactosidases α aspergillus terreus biochemical characterization α

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