MSH2 e o reparo de erros de pareamento em tripanossomatídeos: análises in vitro e in vivo e envolvimento na resposta a estresse oxidativo
AUTOR(ES)
Alice Machado da Silva
DATA DE PUBLICAÇÃO
2008
RESUMO
Estudos recentes realizados pelo nosso grupo demonstraram que a espécie Trypanosoma cruzi pode ser dividida em três haplogrupos distintos, denominados A, B e C. Essa classificação está baseada em uma extensa análise de microssatélites e polimorfismos de vários genes em diversas cepas desse parasita, incluindo o gene MSH2, que codifica um componente essencial da via de reparo de erros de pareamento (MMR). Tratamento com agentes genotóxicos sugeriu que cepas dos haplogrupos B e C apresentam menor eficiência de MMR se comparado com cepas do haplogrupo A. Esses resultados nos levaram a propor que essa menor eficiência de MMR poderia estar correlacionada à maior variabilidade genética encontrada nessas cepas, como demonstrado em estudos recentes sobre famílias de genes multi-cópias. Cabe notar que as cepas pertencentes ao haplogrupo C estão normalmente associadas aos casos crônicos da doença de Chagas no Brasil. Portanto, é possível que essa maior variabilidade genética tenha contribuído para uma maior capacidade de adaptação dessas cepas ao ciclo doméstico da doença de Chagas. Como cada um dos haplogrupos é caracterizado por uma isoforma distinta de MSH2, decidimos aprofundar a caracterização dessa proteína e investigar se ela poderia ser responsável pelas possíveis diferenças de MMR entre haplogrupos. O MSH2 foi amplificado a partir de DNA genômico das cepas de T. cruzi Colombiana (haplogrupo A) e CL Brener (uma cepa híbrida apresentando os alelos de MSH2 dos haplogrupos B e C) e sua região codificadora foi seqüenciada. Foram encontradas 29 substituições de aminoácidos entre o MSH2 dessas cepas, algumas delas em regiões descritas como importantes para a manutenção da estrutura ou função dessa proteína. Análises in silico indicaram que as diferenças entre o MSH2 de Colombiana e CL Brener não levam a alterações estruturais. Visando verificar sua atividade in vitro, o MSH2 dessas cepas foi expresso em E. coli e as proteínas recombinantes utilizadas em um ensaio funcional de hidrólise de ATP. A proteína MSH2 de Colombiana apresentou maior atividade ATPásica in vitro quando comparada à de CL Brener, sugerindo que os SNPs encontrados podem ser responsáveis pelas diferenças observadas nas respostas a tratamentos com agentes genotóxicos. Visando comparar a atividade do MSH2 de CL Brener e Colombiana in vivo optamos pela expressão heteróloga dessas isoformas de MSH2 de T. cruzi em linhagens de Trypanosoma brucei MSH2 -/-. Entretanto, as análises de instabilidade de microssatélite e tratamento com MNNG indicaram que a complementação da via de MMR em T. brucei através da expressão de MSH2 de T. cruzi não é possível. Por outro lado, esse modelo nos permitiu avaliar a participação do MSH2 na resposta ao estresse oxidativo nesse parasita. Semelhante ao observado com linhagens de T. cruzi MSH2+/-, linhagens de T. brucei MSH2 -/- são mais susceptíveis ao tratamento com peróxido de hidrogênio (H2O2) do que células selvagens. Ensaios com células de T. brucei MLH1-/- demonstraram que MLH1, uma proteína que atua juntamente com o MSH2 no MMR, não está envolvida nesse processo. O fato do MSH2 de T. cruzi não ter sido capaz de complementar a via de MMR em T. brucei MSH2 -/-, associado à não participação do MLH1 na resposta a tratamento com H2O2, nos levou a propor que, em tripanossomatídeos, MSH2 teria um papel adicional na resposta a estresse oxidativo, sendo essa uma função independente do MMR.
ASSUNTO(S)
tripanossoma cruzi teses. estresse oxidativo teses dna recombinante teses. bioquímica teses. reparo de erro de pareamento de dna.
ACESSO AO ARTIGO
http://hdl.handle.net/1843/CMFC-7FNMEZDocumentos Relacionados
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