Efeitos do veneno de Rhinella schneideri sobre a junção neuromuscular / Effects of Rhinella schneideri poison on neuromuscular junction

AUTOR(ES)
FONTE

IBICT - Instituto Brasileiro de Informação em Ciência e Tecnologia

DATA DE PUBLICAÇÃO

15/02/2012

RESUMO

Rhinella schneideri, conhecido previamente como Bufo paracnemis, é um sapo comum em muitas regiões do Brasil. O veneno destas espécies exerce importante efeito cardiovascular em humanos e animais, mas pouco se sabe sobre sua atividade neuromuscular. Neste trabalho, nós avaliamos a neurotoxicidade do veneno de R. schneideri em preparações neuromusculares de pintainho e camundongo. Através da compressão manual das glândulas parótidas localizadas atrás dos olhos, coletou-se a secreção e então realizada a extração com metanol. O extrato metanólico foi liofilizado e testado em preparações biológicas. Preparações biventer cervicis (BC) de pintainho e nervo frênico diafragma (NFD) de camundongo foram utilizadas para o registro miográfico através de estimulação elétrica indireta para medidas eletrofisiológicas, análise morfológica e microscopia eletrônica de transmissão. Frações ativas do extrato metanólico foram obtidas submetendo-se à coluna de fase reversa Luna PFP (250 x 4,6 mm). O extrato metanólico (50 ?g/ml) causou somente facilitação da neurotransmissão em preparações NFD. Ao contrário, causou bloqueio neuromuscular significativo em preparações BC que foram concentração-dependente (3, 10 and 30 ?g/ml; a 37º C) com tempo para 50% de bloqueio, média ± erro padrão: 84±10, 51±3 e 12±0,8 min com 3, 10 e 30 ?g/ml, respectivamente; n=6-8 cada, precedido por facilitação da neurotransmissão. Não houve inibição significativa das respostas contraturantes à ACh (110 ?M) ou KCl (20 mM) após bloqueio completo em qualquer concentração testada. Em preparações BC incubadas com o extrato metanólico (10 ?g/ml) a 22º C por 70 min não observou-se qualquer alteração das respostas musculares (117±3%; n=5), mas quando a temperatura do banho foi elevada a 37º C, 50% de bloqueio ocorreu após 92±3 min (n=5; p<0.05). A incubação de preparações BC curarizadas (d-Tc, 1 ?g/ml) com o extrato metanólico (10 ?g/ml) resultou em completo e irreversível bloqueio enquanto que as preparações tratadas somente com curare mostraram a reversão completa da resposta contrátil após várias lavagens. Não houve aumento significativo nos níveis de liberação de creatinoquinase (90±21 vs. 80±15 U/l, antes e após 120 min de incubação com o extrato, respectivamente, n=5) além da ausência de alterações na morfologia das fibras musculares ou na porcentagem de danos na fibra (2.4±0.9 vs. 2.3±0.5 %, antes e após 120 min de incubação com o extrato, respectivamente, n=5). O extrato metanólico (50 ?g/ml) aumentou a resposta contrátil mas não alterou o potencial de membrana em repouso (-81±1 mV e -78±1 mV para controle e preparação tratada após 60 min). Registros eletrofisiológicos mostraram que houve um aumento progressive na frequência dos potenciais de placa terminal em miniatura (PPTM) de 34±3,5 (controle) para 88±15 (após 60 min de incubação com o extrato); houve também um aumento nos valores do conteúdo quântico, de 128±13 (controle) para 272±34 e 171±11 após 5 min e 60 min, respectivamente, em preparações tratadas com o extrato metanólico. A microscopia eletrônica de transmissão mostrou que o volume ocupado pelas vesículas sinápticas foi significativamente reduzida (32±5%; p<0.05) após 5 min mas este efeito foi reversível após 60 min de incubação para as preparações tratadas com 50 ?g/ml do extrato metanólico. Não houve dano estrutural distinguível na membrana do terminal nervoso e nas mitocôndrias das preparações tratadas com o extrato, quando comparada com as preparações controle. O pré-tratamento das preparações NFD com ouabaína (1 ?g/ml), um inibidor da bomba de Na+/K+-ATPase, por 5 min antes da incubação com o extrato, preveniu o aumento do conteúdo quântico comparado com preparações controle (118±18, 117±18 e 154±33 para preparações controle-ouabaína e tratadas com ouabaína e incubadas com o extrato por 5 min e 60 min, respectivamente). A cromatografia por HPLC do extrato metanólico resultou em 24 frações, das quais 4 (frações 20, 21, 22 e 24) causaram bloqueio neuromuscular em preparações BC. A fração 20 (3 ?g/ml) foi escolhida por ser 3 vezes mais potente que as demais e causou bloqueio neuromuscular significativo (p<0.05; tempo para 50% de bloqueio: 43±4 min; n=4) precedido por facilitação em preparações BC a 37º C. A fração 20 não inibiu as respostas contraturantes à ACh (110 ?M) ou KCl (20 mM) após completo bloqueio neuromuscular em preparações BC. Em preparações NFD, a fração (15 ?g/ml) aumentou significativamente os valores do conteúdo quântico de 117±18 (controle) para 236±44 após 5 min de incubação (n=4; p<0.05). Estes resultados indicam que o extrato metanólico do veneno de R. schneideri é capaz de interferir com a neurotransmissão por ativar e/ou bloquear a liberação da acetilcolina nos sítios pré-sinápticos, provavelmente envolvendo a bomba de Na+-K+-ATPase, sem causar qualquer dano à musculatura.

ASSUNTO(S)

junção neuromuscular eletrofisiologia microscopia eletrônica de transmissão neuromuscular junction electrophysiology transmission electron microscopy

ACESSO AO ARTIGO

Documentos Relacionados