Cisteína-proteinases em promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis. / Cysteine-proteinases in promastigotes of Leishmania (Viannia) braziliensis.

AUTOR(ES)
DATA DE PUBLICAÇÃO

2008

RESUMO

No presente trabalho foram detectadas cisteína-proteinases (CPs) em promastigotas infectivas de Leishmania (Viannia) braziliensis. A estratégia de purificação consistiu na associação do método de extração por Triton X-114 com cromatografia em coluna de Concanavalina A-Sepharose, seguida por outra de DEAE-Sephacel. No ensaio das cromatografias, observamos um pico majoritário de atividade enzimática na presença do substrato pEFLpNan (165 x 10-32 μM de pNan/minuto) para cerca de 1010 parasitas, coincidente com o pico majoritário da proteína eluído da coluna de troca iônica. A análise por SDS-PAGE do material eluído da coluna de troca iônica mostrou quatro principais bandas de proteínas com massas moleculares relativas de 63, 43, 30 e 27 kDa. Os ensaios da atividade enzimática após eletroforese mostraram que as bandas de 63 kDa e 43 kDa, hidrolisam substratos como gelatina em pH 7,0 e são sensíveis à presença de E-64. Além disso, as duas enzimas são capazes de hidrolisar o substrato pEFLpNan: 63 kDa (2,2 0,3 μM de pNan/minuto) e 43 kDa (0,05 0,2 μM de pNan/minuto), e são inibidas por 10μM E-64 (47 % e 36 %, respectivamente). Os ensaios de reconhecimento imunológico utilizando um anti-soro policlonal específico contra cisteína-proteinase B [anti-CPB de L. (L.) mexicana] revelaram que as enzimas de 63 kDa e 43kDa são reconhecidas por este anti-soro. Os experimentos de aglutinação, citometria de fluxo e imunocitoquímica utilizando esse mesmo antisoro revelaram que homólogos de CPBs estão localizados na superfície da membrana de promastigotas. Além disso, a incubação dos promastigotas com fosfolipase C (PLC) reduziu o número de células positivas para os homólogos de CPB. Os anti-soros anti-CRD (cross reactive determinat) e anti-CPB reconhecem bandas de 63 kDa e 43 kDa do sobrenadante das células tratadas com PLC em ensaios de immunoblotting sugerindo que isoformas destas proteínas são ancoradas por glicosilfosfatidilinositol (GPI) à membrana plasmática. Também observamos que os homólogos de CPBs são presos a membrana por âncora GPI e se concentram em plataformas lipídicas. Nós observamos que as proteínas homólogas a CPB não permanecem estáveis na superfície da membrana quando os parasitas são mantidos em culturas sucessivas, assim como a atividade enzimática total sobre o substrato pEFLpNan é alterada. Mostramos ainda através da técnica RT-PCR em tempo real um aumento da transcrição de cpb de L. (V.) braziliensis quando os parasitas foram submetidos a culturas sucessivas. De uma forma geral os dados apresentados suportam a hipótese de que o parasita estudado apresentam CPs de membrana ativas, além de homólogos de CPB intracelulares.

ASSUNTO(S)

leishmania braziliensis leishmania braziliensis cysteine endopeptidases enzimas bioquimica dos microorganismos polymerase chain reaction enzymes leishmaniose reação em cadeia da polimerase cisteína endopeptidases leishmaniasis

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