Characterization of the pre, pro and CTE domains of the cysteine proteinase 2 (Lpcys2) of Leishmania pifanoi: paper in lysosomal targeting and infection / Caracterização dos domínios pre-pro e C-terminal da cisteína proteinase Lpcys2 de Leishmania pifanoi: papel em endereçamento lisosomal e infecção

Marcel Marín Villa

O objetivo do presente trabalho foi o estudo das características do domínio pre, pro e C-terminal da cisteína proteinase 2 (Lpcys2) de L. pifanoi e a relação destes domínios com endereçamento ao lisosomo e infecção. Na tentativa de identificar possíveis proteínas que se liguem ao sinal do domínio pro de Lpcys2, inicialmente usamos o sistema de dois híbridos de levedura. Esta estratégia não produziu interações positivas. Nossa interpretação para este resultado negativo foi que o sinal de endereçamento presente no domínio pro Lpcys2 é reconhecido pela maquinaria de endereçamento vacuolar da levedura. Para estudar o reconhecimento do sinal de endereçamento lisosomal Lpcys2 em leveduras, foram realizadas várias construções usando os plasmídeos de levedura que expressam os domínio pre, pro e prepro Lpcys2 fusionados a GFP. Resultados obtidos mostraram endereçamento dos diferentes domínios ao vacúolo de S. cerevisae YRG-2. Um controle negativo usando o plasmídeo pUG23 sem inserto produziu fluorescência citoplasmática. A fluorescência observada com GFP fusionada ao peptídeo sinal pre indica que a entrada na via secretora da levedura foi suficiente para endereçar GFP ao vacúolo. O endereçamento vacuolar observado nas leveduras transformadas com a construção contendo o domínio pro foi realizado provavelmente por mecanismos de transporte diferentes da via secretora clássica como autofagia ou transporte do citoplasma-ao-vacuolo Cvt. Também foram feitos testes de reconhecimento do sinal presente no domínio pro em células de mamíferos. Células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) foram transformadas com o plasmídeo específico para células de mamífero pEGFP contendo GFP em fusão com o domínio prepro Lpcys2. Fluorescência foi observada no complexo de Golgi, como foi comprovado mediante experimentos de co-localização com anticorpos anti-GM-130. Estes resultados demonstraram que o peptídeo sinal Lpcys2 é reconhecido pela maquinaria de translocação do RE em células CHO. Ao contrário do que acontece em leveduras e Leishmania, o sinal de endereçamento lisosomal presente no domínio pro não foi reconhecido em células de mamífero ficando acumulado no complexo de Golgi.Para continuar estudos do mecanismo de endereçamento da Lpcys2 e do papel do domínio C-terminal em infecção, foram feitos peptídeos recombinantes e anticorpos contra estes dois domínios. Usando o anticorpo contra o domínio pro foi visto que o zimogênio da Lpcys2 apresenta diferentes isoformas as quais são preferencialmente expressas no estágio de amastigota e pouco expressas em promastigotas estacionárias, como foi visto por imunofluorescências, microscopia eletrônica e western blot. Usando anticorpos policlonais contra o domínio pro, catalítico e C-terminal foi evidenciado que Lpcys2 sofre processamento. Usando estes anticorpos, foi visto também que L. amazonenses tem uma cisteína proteinase com alta homologia a Lpcys2. Uma vez que não foram obtidos resultados com a metodologia de dois híbridos de levedura, foram usadas outras abordagens para estudar interação do domínio pro com proteínas que participam do endereçamento de Lpcys2. Mediante ligand blot e cross-linking foi visto interação com algumas proteínas tanto de promastigotas como de amastigotas. Por imunoprecipitação foi possível isolar algumas proteínas candidatas de amastigota, como a P4- nuclease, Gliceraldeido-3-fosfato deshidrogenase, histona H4, F1 subunidade α-ATPase, e própria Lpcys2. Mediante microscopia eletrônica e imunolocalização foi vista uma localização do domínio C-terminal em amastigotas axênicos de cultura no megasomo e na bolsa flagelar, enquanto nos amastigotas infectando macrófagos o domínio C-terminal localiza na bolsa flagelar e na superfície do parasita em contato com a membrana do fagosomo. Vimos que o domínio C-terminal tem um papel na infecção da Leishmania em macrófagos, onde em ensaios de inibição de infecção, amastigotas pre-incubados com um anticorpo anti C-terminal foram menos infectantes em comparação com promastigotas igualmente incubados com o anticorpo C-terminal.

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