Characterization of the human Mov34 and PACT proteins and analyses of their interaction with dengue virus RNA / Caracterização das proteinas humanas Mov34 e PACT e analise da sua interação com o RNA do virus da dengue

AUTOR(ES)
DATA DE PUBLICAÇÃO

2008

RESUMO

O combate à dengue atualmente está limitado praticamente aos esforços de eliminação do mosquito transmissor, o Aedes aegypti, porém esta estratégia não tem se mostrado eficiente. O desenvolvimento de novos instrumentos de combate à dengue requer, portanto, maior conhecimento sobre a biologia do vírus com relação à sua interação com seus hospedeiros. O genoma do vírus é constituído por um RNA simples-fita de polaridade positiva e possui duas regiões não traduzidas (5’ e 3’ UTR). A região 5’UTR viral possui organização similar à dos mRNAs eucarióticos, diferentemente da região 3’UTR que é longa e não possui cauda de poli(A). Em vez disso, na região 3’UTR encontram-se estruturas conservadas entre os diferentes Flavivirus, dentre elas a estrutura 3’ stem-loop (3’SL) que é indispensável para a replicação do RNA viral. O objetivo do nosso estudo foi identificar novas proteínas humanas capazes de interagir com a estrutura 3’SL do RNA do vírus da dengue. Dados da literatura descrevem que a proteína Mov34 de camundongo interage com 3’SL do vírus da encefalite japonesa. Devido à alta similaridade entre as proteínas ortólogas humana e de camundongo, bem como das respectivas estruturas 3’SL dos vírus da dengue e da encefalite japonesa, foi testada a interação entre a Mov34 humana com o 3’SL do vírus da dengue. Porém, em nenhuma das condições testadas foi possível obter evidência de interação da Mov34 humana com 3’SL dos vírus da dengue e da encefalite japonesa. Para a identificação de novas proteínas que são capazes de interagir com a estrutura 3’SL do RNA do vírus da dengue foi utilizado o ensaio de triplo-híbrido de levedura. A proteína humana PACT, conhecida como proteína celular ativadora de PKR, foi isolada neste ensaio utilizando 3’SL como isca. PKR é uma quinase ativada por PACT ou RNA dupla-fita. A ativação de PKR leva a um estado antiviral adquirido pela fosforilação do fator de iniciação da tradução eIF2α e conseqüente inibição da tradução. Além disso, PKR está envolvida em outras vias de transdução de sinal e na resposta celular à proteínas desenoveladas. A ação antiviral de PACT é evidenciada pela ação de proteínas dos vírus influenza A e herpes simplex tipo 1 que inibem a ativação de PKR por PACT e por RNA dupla-fita. A interação direta de PACT com 3’SL do RNA do vírus da dengue foi confirmada por ensaio de UVcrosslinking PACT possui três domínios de interação com RNA dupla-fita, sendo que os dois domínios N-terminais são responsáveis pela sua interação com o 3’SL. Foi identificada uma região específica do 3’SL, o stem-loop superior, onde PACT interage com maior afinidade. Além disso, foi mostrado que PACT endógena de células HEK293 é capaz de interagir com o 3’SL biotinilado. Para caracterizar a função desta interação durante a infecção viral, foi desenvolvida uma linhagem celular com inibição da expressão de PACT através da técnica de RNA de interferência. Com esta linhagem poderemos analisar a importância da interação entre PACT e o RNA do vírus da dengue quanto à ativação e/ou inibição de PKR durante a infecção viral.

ASSUNTO(S)

dengue viruses proteina mov34 humana human mov34 protein protein-rna interaction 3 untranslated regions human pact protein interação proteina-rna proteina pact humana virus da dengue

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