Celula progenitora de sangue de cordão umbilical humano : viabilidade para reconstituir linhagem hematopoietica e terapia genica

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DATA DE PUBLICAÇÃO

1998

RESUMO

Nos últimos anos, o sangue de cordão umbilical humano (scuh) vem se tornando fonte alternativa viável, para obtenção de célula precursora de linhagem hematopoiética devido à facilidade em ser obtido, manipulado e rico em células precursoras. Estas células são mais imaturas que as da medula óssea, tendo grande capacidade de proliferação, replicação e transfecção. Apresenta, quando transfectada, maior expressão do material introduzido. No intuito de estudar a viabilidade destas células para reconstituir linhagem hematopoiética, analisamos sua capacidade de proliferação em cultura em meio de metilcelulose, antes e após criopreservação e transplantando-as em camundongos portadores de imunodeficiência severa combinada (SCID), irradiados. Foram coletadas, no período de junho de 1996 a agosto de 1998, 75 bolsas de scuh. Houve uma variação no volume de sangue coletado de 1 a 120 ml com média de 57 ml. O número médio de células viáveis foi de 119 x105 /ml de sangue de cordão. Nos estudos clonogênicos as médias observadas foram 216 colônias de CFU/BFU-E, 134 colônias de CFU-GM e 22 colônias de CFU-GEMM. Durante o estudo notamos uma proliferação intensa nas culturas de sangue de cordão de prematuros quando comparados com os neonatos de termo. Os prematuros apresentaram um maior número de células precursoras viáveis (371 x 105/ ml de sangue de cordão) que os de termo (74 células. x 105/ ml de sangue de cordão) Na leitura feita no 8° dia de cultura, encontramos 284 CFU/BFU-E nos prematuros e 19 colônias nos de termo (p=0,003). Em relação às CFU-GM os prematuros apresentaram 196 colônias/ml de sangue de cordão e os de termo 15 colônias Iml (p=0,003). Foram encontradas 29 colônias de CFU-GEMMM nos prematuros e nenhuma colônia nos de termo (p=0,003) No 14° dia, os prematuros apresentaram 358 colônias de CFU/BFU-E e os de termo 216 colônias (p=0,061); 219 colônias de CFU-GM e os de termo 120 colônias (p=0,075); 41 colônias de CFU-GEMM e os de termo 23 colônias (p=0,040). Tal fato poderia estar relacionado com o maior número de células precursoras existente em prematuros que se relaciona com a ontogenia da hemopoiese. Entretanto a diferenciação nos diferentes tipos de colônia se encontra também acelerado. As culturas dos prematuros no 8° dia foram semelhantes às de termo no 14° dia, já apresentando grande quantidade de CFU-GEMM. As culturas do 14° dia já apresentavam BFU-E, as quais, só aparecem nas de termo no 21° dia, apresentando também, intensa proliferação celular, dificultando a contagem. Provavelmente as células dos prematuros analisados (idade gestacional entre 20 e 32 semanas) devem entrar em ciclo celular antes que as de termo. Este achado está sendo objeto de estudo o estudo da viabilidade das células após o congelamento demonstrou que elas permaneceram viáveis após a crio preservação, mantendo, nos estudos clonogênicos, sua capacidade proliferativa e na imunofenotipagem, a proporção de células CD34+ foi semelhante à realizada pré- congelamento. O transplante foi realizado em 20 camundongos de linhagem SCID/SCID, após terem sido irradiados com 300 rads de fonte de Césio, injetando-se 1,0 x 10 7 células mononucleares de scuh em veia orbitária. Concomitantemente, num dos experimentos foi sacrificado um animal sem ser irradiado e transplantado, sendo feita a avaliação do mesmo modo que para avaliar a pega dos transplantados. Para avaliação da pega, os camundongos foram sacrificados 8 semanas após transplante, sendo feita cultura de lavado de medula óssea dos camundongos em meio sem i-sólido de metilcelulose com fatores estimulantes de crescimento recombinantes, específicos para linhagem celular humana e análise através de imunofenotipagem por citometria de fluxo com anticorpos monoclonais para células humanas. Foram obtidas amostras de sangue periférico, macerado de pulmão, baço e de lavado de medula óssea A pega na 8a semana pós transplante ocorreu em 6 dos 21 camundongos; 15 animais morreram na 1 a semana pós, irradiação, o que pode acontecer pois a linhagem SCID é mais sensível que as outras linhagens. Houve intensa proliferação nas culturas, dificultando a contagem das CFU-C. A análise através da citometria de fluxo foi positiva em 3 dos 6 casos. Foram analisados 6.000 a 10.000 eventos. A porcentagem encontrada de células captadas pelos anticorpos foi expressa em relação ao campo de linfócitos. Foram encontradas, no sangue periférico, 400 células com 26,03% de CD45, 4,50% de CD2, 30,14% de CD3, 1,03% de CD19. No pulmão, 2500 células com 18,65% de CD45, 16,32% de CD3 e 0,37% de CD19. Na medula óssea, 1000 células, com 12,80% de CD45, 4,45% de CD3, 0,855 de CD8, 0,03% de CD34. No baço, haviam 2300 células sendo 36,84% de CD45, 28,27% de CD3, e 1,62% de CD19. No camundongo sem transplante não houve marcação para células humanas. Mediante os dados apresentados, que se relacionam com os da literatura, as células precursoras do sangue de cordão são capazes de reconstituir a linhagem hematopoiética após ablação da medula e devido às suas caracteristicas, imaturidade, grande capacidade de proliferação e autogeração podem ser adequadas para terapia gênica .

ASSUNTO(S)

etc tecidos transplante de orgãos sangue

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