Caracterização bioquimica de uma lectina e determinação da estrutura primaria de um inibidor de serinoproteinases tipo Kunitz de sementes de Delonix regia(Flamboyant) : estudo in vitro da ação inseticida do inibidor

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DATA DE PUBLICAÇÃO

2003

RESUMO

Os objetivos deste trabalho foram purificar e caracterizar bioquimicamente uma lectina e determinar a estrutura primária de um inibidor de serinoproteinases tipo Kunitz de sementes da espécie D. regia (Leguminosae-Caesalpinioideae) e também verificar o efeito in vitro do inibidor sobre a atividade das enzimas digestivas dos insetos lepidópteros A. kuehniella e C. cephalonica. Para a purificação da lectina e do inibidor de serinoproteinases, as sementes foram trituradas e a farinha foi submetida a uma extração salina 10%. Após centrifugação, o sobrenadante (extrato total) foi dialisado, liofilizado e aplicado em colunas de exclusão molecular, troca iônica e coluna de fase reversa C18 em sistema de HPLC. As frações eluídas foram monitoradas a 280 nm de absorbância. A lectina e o inibidor purificados foram designados como DRL (Delonix regia lectin) e DrTI (Delonix regia trypsin inhibitor), respectivamente. Após a identificação e purificação, a lectina foi analisada em SDS-PAGE 12,5%, revelando que esta proteína tem massa molecular aparente de 12 kDa sob condições redutoras (DTT 0,1 M) e não redutoras. O gel nativo revelou que DRL é uma proteína constituída por apenas uma cadeia polipeptídica. Os testes de inibição da atividade hemaglutinante foram realizados com eritrócitos de ratos, utilizando-se os seguintes açúcares: D-glicose, D-glicosamina, D-frutose, D-manose, D-sacarose, D-galactose, D-galactosamina, D-rafinose, Dlactose e D-maltose e verificamos que a atividade hemaglutinante de DRL foi inibida mais especificamente por glicose a uma concentração de 0,048 mM, indicando que esta lectina pertence ao grupo glicose-manose. A composição de aminoácidos da lectina mostrou alto conteúdo de ácido aspártico, ácido glutâmico e glicina, mas nenhum resíduo de cisteína foi observado. A determinação da região N-terminal da lectina revelou alta homologia com outras lectinas de leguminosas tais como, con A, lentilha e ervilha. A faixa de pH para a atividade da lectina foi de 8-9 com perda total da sua atividade em faixa de pH ácido (2-4). Além disso, a lectina manteve sua atividade após tratamento térmico a 70°C, durante 30 minutos, com perda de 50% de sua atividade a 100°C. DRL não necessitou de cálcio para sua atividade, mas é dependente de manganês, sugerindo que DRL é uma metaloproteína. O tratamento de DRL com uréia resultou em perda total da AHE, enquanto que na presença do DTT, a lectina manteve sua atividade normal provavelmente devido à ausência de pontes dissulfeto na molécula. A determinação da estrutura primária do DrTI, comprovou que este inibidor pertence à família Kunitz de inibidores de proteinases. A região do sítio reativo possui um resíduo de ácido glutâmico ao invés de arginina ou lisina, mas a molécula apresentou dois "Ioops" compostos por quatro resíduos de cisteína com alta similaridade com outros inibidores tipo Kunitz. Os estudos de inibição in vitro mostraram que, numa concentração de apenas 5J.lg, o DrTI inibiu cerca de 92% da atividade das proteases dos insetos A. kuehniella e C. cepha/onica, indicando alta afinidade do inibidor por estas enzimas. A digestibilidade in vitro do DrTI pelas proteases dos insetos foi analisada em SDS-PAGE 12,5% e revelou que o inibidor foi resistente à proteólise após 72h. Entretanto, a incubação do DrTI com a tripsina bovina resultou em clivagem nos primeiros 30 minutos de reação. A atividade residual máxima do inibidor, após estes ensaios de digestibilidade pelas proteases de A. kuehniella, C. cephalonica e tripsina bovina foi de 69,5%, 64,9% e 34,57%, respectivamente

ASSUNTO(S)

sementes lepdoptero lectinas

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