A two-plasmid strategy for engineering a dengue virus type 3 infectious clone from primary Brazilian isolate

AUTOR(ES)
FONTE

An. Acad. Bras. Ciênc.

DATA DE PUBLICAÇÃO

2014-12

RESUMO

As infecções causadas por dengue representam uma das mais prevalentes doenças transmitidas por artrópodes mundialmente, causando um amplo espectro de manifestações clínicas. A tecnologia de clones infecciosos é uma importante ferramenta para o entendimento da biologia do vírus da dengue (DENV). Clones de cDNA infeccioso têm sido construídos para muitos vírus de RNA com cadeia positiva e são ferramentas valiosas para o estudo dos mecanismos moleculares envolvidos na replicação do genoma viral, montagem da partícula viral, patogênese viral, e desenvolvimento de vacinas. No presente trabalho, nós descrevemos o desenvolvimento de um clone infeccioso baseado num isolado primário brasileiro do vírus Dengue sorotipo 3 (DENV3), genótipo III. Usando uma estratégia de dois plasmídeos, o genoma viral foi dividido em duas partes e os fragmentos gerados foram clonados separadamente num vetor shuttle levedura-bactéria. Os plasmídeos foram construídos pela técnica de recombinação homóloga em levedura e a transcrição do genoma completo foi realizada a partir ligação in vitro das duas partes do genoma. O transcrito de DENV3 se mostrou infeccioso quando transfectado em células BHK-21 e a identidade do clone infeccioso foi confirmada por caracterização in vitro. A cinética de crescimento do DENV3 gerado neste sistema foi indistinguível do vírus parental. Este sistema representa uma poderosa ferramenta que ajudará na elucidação de aspectos moleculares da biologia do DENV bem como no estudo de mutações associadas com patogênese do DENV.Dengue infections represent one of the most prevalent arthropod-borne diseases worldwide, causing a wide spectrum of clinical outcomes. Engineered infectious clone is an important tool to study Dengue virus (DENV) biology. Functional full-length cDNA clones have been constructed for many positive-strand RNA viruses and have provided valuable tools for studying the molecular mechanisms involved in viral genome replication, virion assembly, virus pathogenesis and vaccine development. We report herein the successful development of an infectious clone from a primary Brazilian isolate of dengue virus 3 (DENV3) of the genotype III. Using a two-plasmid strategy, DENV3 genome was divided in two parts and cloned separately into a yeast-bacteria shuttle vector. All plasmids were assembled in yeast by homologous recombination technique and a full-length template for transcription was obtained by in vitro ligation of the two parts of the genome. Transcript-derived DENV3 is infectious upon transfection into BHK-21 cells and in vitro characterization confirmed its identity. Growth kinetics of transcript-derived DENV3 was indistinguishable from wild type DENV3. This system is a powerful tool that will help shed light on molecular features of DENV biology, as the relationship of specific mutations and DENV pathogenesis.

ASSUNTO(S)

agricultural sciences biological sciences engineering exact and earth sciences health sciences human sciences

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